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赤眼鳟LGP2基因多克隆抗体的制备方法

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成果类型:
专利
发明/设计人:
李耀国;肖调义;赵鑫
申请/专利权人:
湖南农业大学
专利类型:
发明专利
语种:
中文
申请时间:
2019-11-16
申请/专利号:
CN201911122747.3
公开时间:
2020-02-07
公开号:
CN110760000A
主申请人地址:
410128 湖南省长沙市芙蓉区湖南农业大学
申请地区:
湖南
机构署名:
本校为第一完成单位
主权项:
1.赤眼鳟LGP2基因多克隆抗体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤: (1)赤眼鳟LGP2基因的克隆 提取赤眼鳟肾脏组织总RNA,反转录合成5’和3’cDNA第一链;设计两对特异性引物:LGP2-5’(W)和LGP2-3’(W),LGP2-5’(N)和LGP2-3’(N),核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4所示;LGP2-5’(W)和LGP2-3’(W)分别用于第一轮的5’和3’RACE-PCR扩增;所得PCR产物作为第二轮PCR的模板;利用LGP2-5’(N)和LGP2-3’(N)进行第二轮5’和3’RACE-PCR扩增;对PCR产物进行纯化、连接T载体,转化并测序确认;拼接产物序列获得赤眼鳟LGP2基因全长cDNA序列; (2)赤眼鳟LGP2基因重组表达载体的构建 设计特异性引物LGP2-OF和LGP2-OR,核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示;以步骤(1)得到的cDNA为模板进行PCR扩增;将PCR产物和pET-28a(+)表达载体进行KpnI和BamHI的双酶切,纯化回收,经T4连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α,获得重组表达载体pET-28a-SUMO-LGP2并测序验证; (3)赤眼鳟LGP2蛋白表达及破菌流程 将步骤(3)得到的重组表达载体pET-28a-SUMO-LGP2转化大肠杆菌BL21(DE3),在含有卡那霉素的LB培养液中培养至OD值为0.6,加入IPTG进行诱导;离心收集菌体;破菌,利用SDS-PAGE电泳确定蛋白表达及纯度; (4)重组蛋白的纯化及浓度测定 利用纯化试剂盒对步骤(3)得到的重组蛋白上样、洗脱、样品处理及再生处理方法进行纯化;采用Lowry法测蛋白浓度,设置不同浓度的标准蛋白质溶液,绘制标准曲线,根据样品的光吸收值与标准曲线计算样品蛋白浓度; (5)多克隆抗体的制备 将步骤(4)纯化的赤眼鳟pET-28a-SUMO-LGP2表达蛋白作为抗原,对新西兰大白兔进行免疫,收集兔抗血清,纯化得到赤眼鳟LGP2多克隆抗体。 2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,第一轮的5’和3’RACE-PCR扩增反应程序为94℃5min;5个循环的94℃30s,72℃3min;5个循环的94℃30s,70℃30s,72℃3min;25个循环的94℃30s,68℃30s,72℃3min。 3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,第二轮5’和3’RACE-PCR扩增反应程序为94℃5min;25个循环的94℃30s,68℃30s,72℃3min,然后72℃7min。 4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,破菌的方法为:取50mL的1×PBS悬浮菌液,加入50μL巯基乙醇,利用超声破碎仪,设置破菌时间3s,间隔3s,共10min超声破菌,离心10min得到1号上清液和沉淀,其中沉淀用去离子水洗涤两遍,加入6g尿素并用1×PBS溶解定容到44mL,吹悬沉淀;按破菌3s,间隔3s的设置,破菌5min后12000r/min离心10min得到2号上清液和包涵体,吸出2号上清液暂放4℃保存待用,向包涵体中加入6mLddH2O悬浮后平均分装到4个离心管中,12000r/min离心2min;弃上清,选取其中一管加入1.5mL 8M的尿素,溶解,12000r/min离心1min,将上清转移到新的离心管中。 5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(5)中,对新西兰大白兔进行免疫的方法为:对新西兰大白兔进行8次免疫,按体积比1:1的比例加入弗氏完全佐剂,采用背部皮下多点注射;加强免疫选用弗氏不完全佐剂;末次免疫10天后,进行全血分离,收集兔抗血清。 6.用于赤眼鳟LGP2基因的全长cDNA序列克隆的引物对,其特征在于,由两组引物对构成,分别为LGP2-5’(W)和LGP2-3’(W),LGP2-5’(N)和LGP2-3’(N),LGP2-5’(W)和LGP2-3’(W)核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示;LGP2-5’(N)和LGP2-3’(N)核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。 7.用于赤眼鳟LGP2基因克隆的引物对,其特征在于,引物对为LGP2-OF和LGP2-OR,其核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。 8.权利要求6或7所述的引物对在赤眼鳟LGP2基因克隆上的应用。
摘要:
本发明公开了一种赤眼鳟LGP2基因多克隆抗体的制备方法,包括(1)赤眼鳟LGP2基因的克隆、(2)赤眼鳟LGP2基因重组表达载体的构建、(3)赤眼鳟LGP2蛋白表达及破菌流程、(4)重组蛋白的纯化及浓度测定和(5)多克隆抗体的制备。本发明成功制备赤眼鳟实验遗传和生理基因2多克隆抗体,可用于检测赤眼鳟组织的LGP2蛋白水平,为鱼类抗病育种研究提供蛋白水平检测工具。

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