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一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法

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成果类型:
专利
发明/设计人:
黄国华;宋晓慧;李梓琦;黎妮
申请/专利权人:
湖南农业大学
专利类型:
发明专利
语种:
中文
申请时间:
2020-01-20
申请/专利号:
CN202010064413.1
公开时间:
2020-06-05
公开号:
CN111235309A
主申请人地址:
410128 湖南省长沙市芙蓉区农大路1号
申请地区:
湖南
机构署名:
本校为第一完成单位
主权项:
1.一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法,其特征在于,该方法步骤如下: 1)病毒的收集及样品的处理:收集感染囊泡病毒的待测样品,超声破碎,稀释后过滤; 2)细胞感染及计数:将昆虫细胞接种于6孔板中,加入步骤1)得到的囊泡病毒稀释液,恒温箱培养,收集囊泡病毒细胞,计数; 3)病毒基因组拷贝数的计算:以步骤2)收集到的细胞提取基因组DNA,以提取的DNA为模板进行绝对定量PCR检测;以含有该DNA片段的pGEM-T载体为标准品,绘制绝对定量PCR检测的标准曲线;对待测样品进行qPCR检测,根据所产生的Ct值基于该标准曲线计算样品中含有的病毒基因组拷贝数; 4)囊泡病毒滴度计算:基于步骤3)得到的病毒基因组拷贝数及步骤2)的病毒细胞数量,计算样品中的囊泡病毒滴度。 2.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法,其特征在于,所述囊泡病毒为HvAV、SfAV、TnAV或DpTV。 3.如权利要求2所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法,其特征在于,所述步骤3)中绝对定量PCR检测所用引物是对应所述病毒设计的。 4.如权利要求3所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法,其特征在于,所述囊泡病毒HvAV的引物序列如下: AV-F:ATGAAAGCCGTGCTTAACGT, AV-R:CTAGCCGGTGTGGTGGGTGT。 5.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法,其特征在于,所述骤3)中绝对定量PCR扩增反应体系为:SYBR Primix Ex Tap II:5μL,DNA模板:0.5μL,上游引物:0.4μL,下游引物:0.4μL,加水至10μL。 6.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法,其特征在于,所述骤3)中绝对定量PCR扩增反应程序为:95℃预变性1s,然后95℃10s、55℃10s、72℃35s,共40个循环。 7.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法,其特征在于,所述步骤1)待测样品稀释液中囊泡病毒浓度为1×10 2~1×1011病毒基因拷贝/mL。 8.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法,其特征在于,所述步骤2)中昆虫细胞为草地贪夜蛾卵巢细胞Sf9细胞、草地贪夜蛾卵巢细胞Sf21细胞或甜菜夜蛾脂肪体细胞系SeFB细胞。 9.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法,其特征在于,所述步骤2)中昆虫细胞的个数为1.0~9.9×105个/mL。 10.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法,其特征在于,所述步骤2)培养温度为27℃,时间为1h。
摘要:
一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法,是将含囊泡病毒的待测样品超声破碎,然后稀释、过滤,用其感染对数生长期细胞1h,收集细胞悬液、计算细胞数量,提取总DNA;对上述DNA进行qPCR检测,以含有该片段的pGEM‑T载体为标准品,绘制绝对定量PCR检测的标准曲线。根据样品的Ct值计算出每样品中含有的病毒基因组拷贝数。根据感染复数公式,计算感染每个细胞的平均病毒粒子数量,即感染时病毒与细胞数量的比值计算病毒滴度。本方法测定囊泡病毒滴度,当样品浓度为1×102~1×1011病毒基因拷贝/mL时检测时间仅需4‑6h,耗时短,与传统的病毒滴度检测方法相比,操作简单快捷,准确,极大提高了...

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